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Nature Methods:打破局限,研发抑制性神经递质荧光探针iGABASnFR

脑科学新闻2019.8.1我想在哺乳动物中枢神经系统中分享一种重要的抑制性神经递质。大约30%的中枢突触部位使用GABA作为发射器,主要发现在神经元的细胞膜上。它是GABAA和GABAC的亚型。

关于基因编码的钙编码指标的研究很多,并且已经进行了许多改进。还开发了兴奋性神经递质探针,但在抑制性递质探针中没有特别大的突破(1)。

以前的研究已经报道了与GABAB受体上的有机荧光团相连的半合成有机荧光探针,但它们对GABA(400μM)的低亲和力具有有限的应用(2)。因此,寻找新的GABA荧光探针将有助于促进神经科学领域的研究。

最近,美国Howard Hughes医学研究所的Loren L. Looger教授发表了一篇关于GABA体内成像的基因编码荧光传感器的文章,该文章基于谷氨酸受体iGluSnFR的原理来开发可检测的GABA浓度。荧光探针iGABASnFR(3)。

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尽管GABA具有许多潜在的支架蛋白,但GABAAB不适合,因为前GABA结合位点位于蛋白质 - 蛋白质界面(而不是分子内),而后者难以异源表达。

此外,这些受体的过表达可能改变细胞的生理功能。植物病原体根癌土壤杆菌含有两种与GABA,Atu2422和Atu4234结合的蛋白质。其中,Atu2422具有低亲和力,Atu4234具有高亲和力。然而,在不同位置插入cpGFP(绿色荧光蛋白)后,Atu4243不能在离体细胞膜上表达,表明Atu4243不适合作为GABA荧光探针的骨架。

研究人员最终在大肠杆菌中鉴定出异源表达的蛋白质Pf622(Atu4243的同源物),并将其转化为可检测GABA浓度的荧光探针iGABASnFR(图1)。

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iGABASnFR体外实验的可行性:携带iGABASnFR感染的新生大鼠(D0)和体外培养的海马神经元的AAV病毒。免疫荧光显示感染后第14天iGABASnFR与细胞膜高度一致,荧光强度较强。这表明iGABASnFR具有良好的胶片定位。

为了进一步证实iGABASnFR的实用性,在电刺激后,研究人员推动了CA1锥体神经元促进GABA释放后iGABASnFR的快速释放,增加的荧光强度和良好的信噪比。

iGABASnFR在实验中的可行性:局灶性新皮质癫痫通常伴有异常的皮质脑电图(ECoG)活动,这主要是由GABA的参与引起的。因此,研究小组通过癫痫模型进一步测试了iGABASnFR的可行性。毛果芸香碱皮质内注射可引起局部癫痫。当癫痫发作期间发生异常高频放电活动时,GABA释放增加,并且荧光信号也迅速增加。

此外,研究人员进一步验证了斑马鱼的模型。以前的研究表明,游泳可以激活小脑浦肯野细胞释放GABA,并且可以使用光成像技术在斑马鱼小脑中观察到GABA瞬变(4)。使用iGABASnFR标记技术在游泳开始后200ms处荧光变化达到峰值(图2)。该结果表明iGABASnFR可以在运动期间可靠地检测局部GABA转移过程。

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总之,本文基于兴奋性神经递质荧光探针的原理设计了抑制性神经递质荧光探针iGABASnFR,可以快速,稳定地检测细胞外GABA浓度。然而,值得注意的是,异氟醚麻醉期间GABA释放的减少会影响iGABASnFR检测的效率。

参考文献:

1.马文,J。S.等。谷氨酸传感器iGluSnFR的稳定性,亲和力和色度变体。纳特。方法15,936C939(2018)。

2.Masharina,A.Reymond,L.Maurel,D.Umezawa,K。& Johnsson,K。用于GABA和合成GABAB受体配体的荧光传感器。 J. Am。化学。 SOC。 134,C(2012)。

3.遗传编码的荧光传感器,用于GABA的体内成像,

4. Scalise,K。Shimizu,T.Hibi,M。& Sawtell,N。B.小鼠浦肯野细胞在幼虫斑马鱼的虚拟运动行为中的反应。 J.神经生理学。 116,2067C2080(2016)。

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